产品货号：
SN0055
中文名称：
染料法荧光定量PCR预混液
英文名称：
2×BB SYBR qPCR Mix
产品规格：
5mL
发货周期：
1～3天
产品价格：
询价
简要说明：
产品特点：
适用范围：
产品组成：
保存：-20℃，避光，有效期1年。
注意事项：
使用方法：
结果分析：
常见问题：
相关搜索：染料法荧光定量PCR预混液，2×BB SYBR qPCR Mix
本制品是采用SYBR Green I嵌合荧光法进行qPCR反应的专用试剂。产品中包含抗体修饰的新型热启动BB AntiQ DNA polymerase和精心优化的Buffer，能有效抑制低温下的非特异性扩增，大大提高了反应特异性和扩增效率，能够在更宽广的范围内进行准确定量。此外，本制品含有独特的校正染料，与一系列qPCR仪器兼容，包括需要ROX校正的仪器，实验过程中无需额外添加染料来校正仪器。
产品特点：
- 高特异性：采用抗体修饰的新型热启动BB AntiQ DNA polymerase和精心优化的Buffer。
- 操作简便：2×预混液中包含有qPCR反应所需所有组分，只需加入模板、引物和水即可进行反应。
适用范围：
本制品适用于试剂盒提取的基因组DNA、cDNA、质粒DNA和λDNA等样本的扩增定量。
产品组成：
| 组分 | 规格 |
| 2×BB SYBR qPCR Mix | 1mL×5 |
| 说明书 | 1份 |
保存：-20℃，避光，有效期1年。
注意事项：
- 使用前请充分溶解混匀，尽量避免反复冻融，以免酶活下降。
- 本制品中含有SYBR Green I，需避光保存，使用时尽量避免强光照射。
- 为了避免气溶胶污染，建议使用实验环境核酸清洁剂对实验台面及操作环境进行清洁。
- 为不影响后续实验，建议做预实验检查引物有效性和特异性。
- 上机前，注意消除体系中的气泡，以免对结果造成影响。
使用方法：
- 按下表在冰上配制qPCR反应体系
成分 用量 终浓度 2×BB SYBR qPCR Mix 10μL 1× 引物1 (10μM) 0.4μL 0.2μM 引物2 (10μM) 0.4μL 0.2μM 模板DNA 按需要 - ddH2O 至20μL - - 引物终浓度推荐0.2μM，当反应性能较差时，可在终浓度0.2～1.0μM范围内调整引物浓度。推荐引物长度25bp左右、Tm值60℃～65℃为佳，GC含量控制在50%左右、3’端最后一个碱基最好为G或C，比对引物避免3’端或引物间有非特异性互补；
- 为保证扩增效率，建议将模板适当稀释后再进行qPCR反应。若模板为cDNA原液，则使用体积不超过qPCR反应总体积的1/10，即2μL/20μL体系。
- 引物终浓度推荐0.2μM，当反应性能较差时，可在终浓度0.2～1.0μM范围内调整引物浓度。推荐引物长度25bp左右、Tm值60℃～65℃为佳，GC含量控制在50%左右、3’端最后一个碱基最好为G或C，比对引物避免3’端或引物间有非特异性互补；
- 推荐的qPCR反应程序
- 两步法扩增程序
步骤 温度 时间 循环数 预变性 95℃ 30s 1 变性 95℃ 10s 40 退火/延伸 60℃ 30s - 三步法扩增程序（当模板浓度低或qPCR扩增效率低时可尝试）
步骤 温度 时间 循环数 预变性 95℃ 30s 1 变性 95℃ 10s 40 退火 55～65℃ 10s 延伸 72℃ 30s
- 根据引物的Tm值进行退火/延伸（退火）温度的设定；若扩增片段在200bp以内，退火/延伸（延伸）时间可以设置为15sec；此外，退火/延伸（延伸）时间的设置还需根据您使用的qPCR仪所需要的最短数据采集时间自行调整。
- 熔解曲线使用仪器默认程序即可。
- 两步法扩增程序
结果分析：
- 无模板阴性对照(NTC)：若NTC的CT值大于35或无CT，则体系不存在污染；若CT值小于35，则体系可能存在污染或引物不特异，形成引物二聚体，建议清洁实验环境、更换无菌水、检查引物是否污染，或适当降低引物浓度、优化引物设计。
- 扩增曲线及CT值：标准扩增曲线呈光滑的“S”型。一般情况下目的基因Ct值在20～30之间，内参Ct值在15～20之间。若Ct值较小，建议稀释模板；若Ct值较大，建议提高模板浓度或增大反应体系；若Ct值大于35，检测结果无法定量分析基因的表达量，但可用于定性分析。
- 熔解曲线：标准熔解曲线呈单峰。若熔解曲线出现双峰或者多峰，可能存在污染、引物二聚体或非特异扩增，建议降低引物浓度或优化引物设计。
常见问题：
- 无Ct值出现？
- 采集荧光信号的步骤有误。检查程序设置，两步法扩增在退火延伸步骤采集信号，三步法扩增在延伸阶段采集信。
- 引物或模板降解。PAGE电泳检测引物完整性，琼脂糖凝胶电泳检测模板DNA或RNA的质量及完整性，RNA模板建议重新逆转录获得cDNA，cDNA应尽快使用。
- 模板量不足。适当增加模板用量或重新制备高浓度模板。
- 采集荧光信号的步骤有误。检查程序设置，两步法扩增在退火延伸步骤采集信号，三步法扩增在延伸阶段采集信。
- 实验重复性差？
- 加样存在误差。使用性能较好的移液枪，配制预混液后分装，减少移液误差。
- 荧光定量PCR仪器不同位置温度控制不一致。定期校准仪器。
- 模板浓度低或拷贝数低。适当增加模板用量。
- 加样存在误差。使用性能较好的移液枪，配制预混液后分装，减少移液误差。
- 扩增曲线形状异常？
- 扩增曲线不光滑。信号太弱，经系统矫正后产生，可提高模板浓度重复实验。
- 扩增曲线断裂、骤降。模板浓度较高或反应管内留有气泡，减小基线终点(CT值-4)重新分析数据，或上机前离心并仔细检查反应管内是否有气泡残留。
- 扩增曲线不光滑。信号太弱，经系统矫正后产生，可提高模板浓度重复实验。
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